1993年出演王杰歌曲《我》MV女主角。 1995年，林美贞出演第一部正式意义上的电视剧《香帅传奇》，与郑少秋、杨丽菁等人搭戏，在剧中饰演苏蓉蓉。 1998年4月出演电视剧《挚爱奇缘》，在剧中饰演温蒂。 1999年主演电视剧《情迷海上花》，在剧中饰演周小冰。同年8月，与古天乐、吴镇宇共同主演电影《爆裂刑警》，在剧中饰演田缘。该片获得第五届香港电影金紫荆十大华语片奖以及第五届长春电影节评委特别奖。同年9月，主演电影《反骨仔》，在剧中饰演贞子。除此之外，林美贞在1999年还在其他一些电影和电视剧中客串。 2000年主演了电视剧《大地之女》，饰演小萍。同年出演电影《战马》，在剧中饰演桂香。 2001年林美贞出演电视剧《天命因缘》在剧中饰演雁萍。同时参演电视剧《凤舞九天》，在剧中饰演沙曼。同年主演电影《每天吓你八小时》，出演samantha。 2003年出演电视剧《第八号当铺》，饰演苏婷。 2004年4月出演电影《追踪眼前人》，饰演BO。同年5月出演中韩合作电视剧《紫藤恋》，与林心如搭戏。剧中林美贞饰演何慕茵。 2005年出演电视剧《风云世家》，饰演阿萍。 2006年11月出演电视剧《爱情经纪约》，饰演Liya。同年12月出演电视剧《爱情魔发师》饰演Annabelle/银凤。 2007年发布写真集《原寸幻想》。 2012年10月再度复出，与新秀合作出演青春偶像剧《白色之恋》，饰演永拓的母亲韩嘉琳。