2000年，于娜前往北京发展并加入了新丝路模特公司，经过一系列的培训，于娜成为了新丝路模特公司的签约模特并陆续登上了京城几家服装、化妆、健康类杂志的封面；同年5月，于娜参加了首届中国内衣模特大赛并取得了的第4名成绩；同年6月，于娜还担任了北京国展中心大型车展的现场模特，同年9月，于娜在新丝路中国模特大赛北京赛区比赛中一举夺冠，并作为新丝路公司的模特新秀随团赴纽约参加了中国文化美国行的中国服装服饰展演；随后，于娜参加了新丝路中国模特大赛总决赛，她也以优异的表现获得了最终的冠军；同年11月，于娜又在北京世界超模大赛上获得了最佳亚洲形象奖；同年12月，于娜又在中国国际时装周上获得了最佳模特第3名。 2002年，于娜因与印小天、刘烨、傅晶联袂主演根据海岩同名小说改编的都市爱情剧《拿什么拯救你，我的爱人》而正式出道演艺圈，并因在剧中饰演美丽温柔且天真善良的女主角罗晶晶而被更多的观众所熟悉；同年，于娜还与孙俪、何润东、印小天合作出演了爱情偶像剧《一米阳光》。 2003年，于娜与程煜、牛振华、于小慧共同出演了现代警匪剧《荣誉》；同年，于娜还与何炅搭档主演了贺岁话剧《想吃麻花现给你拧》。 2004年，于娜首次出演古装角色，她与张智霖、钟汉良、李小冉合作主演了根据温瑞安同名小说改编的古装武侠剧《逆水寒》，于娜在剧中饰演了红袍诸葛阮明正 ；之后，于娜又与刘烨、佟大为、石微羽共同主演了爱情悬疑剧《夏天的味道》，并在剧中饰演了美丽睿智却又不择手段的李小华；同年；于娜还与吴樾、侯勇、姜昕言联袂主演了根据古典名著古装《水浒传》改编的古装动作剧《浪子燕青》，并在剧中饰演了风华绝代且有情有义的一代名妓李师师；此外，于娜还推出了个人的银幕处女作，她与王志文、吴倩莲、廖凡合作出演了现代惊悚片《天黑请闭眼》。 2005年，于娜与黄晓明、印小天、姜华联袂主演了时尚爱情剧《女才男貌》，并在剧中饰演了女主角善良坚强且心怀梦想的女主角谈孤鸿；随后，于娜又与柳云龙、王奎荣、王华合作主演了根据同名小说改编的谍战悬疑剧《暗算》的第三部《捕风》，并在剧中饰演了美丽热辣的国民党女军官唐一娜；同年，于娜还与高发、刘红雨、潘耀武共同出演了现代警匪剧《心戒》；此外，于娜还出演了广播剧《那些花儿》并推出了首支个人单曲《陪你玩》。 2006年，于娜与王杰、谭耀文、陆毅联袂主演了都市运动剧《高手》，并在剧中饰演了美丽的高球宝贝崔丽娜；之后，于娜又与成泰燊、萨日娜、李万年合作主演了现代情感剧《母亲是条河》，于娜在剧中饰演了母亲角色叶秀，这也是于娜首次饰演母亲角色；同年，于娜还与修庆、于荣光、米学东共同主演了刑侦悬疑局《第七座墓志铭》，并在剧中饰演了女主角关天晴；此外，于娜还在与亓亮、罗珊珊、许还山合作主演的年代情感剧《首富》中饰演了命运多舛的富家千金女荣莎莎；在与盖丽丽、沈佳妮、冯家妹共同主演的现代情感剧《成都往事》中饰演了美丽智慧却充满欲望的钟天心。 2007年，于娜与归亚蕾、彭玉、傅冲共同主演了都市家庭喜剧《饮食男女》，于娜剧中饰演了青春靓丽的都市女孩刘筱慧；之后，于娜又与韩雪、陈浩民、吴卓羲合作主演了都市言情剧《巧克力情人》，并在剧中饰演了清秀美丽且气质过人的章晓妍；同年，于娜还在与王珞丹、连奕名、成泰燊的联袂主演的运动励志剧《排球女将》中饰演了历经磨难最终实现梦想的女主角盛毓妹。 2008年，于娜先是与于荣光、甘婷婷、午马合作出演了探案悬疑剧《侦探成旭之龙城岁月》；之后，于娜又与郭涛、朱雨辰、小李琳联袂主演了都市悬疑剧《高山流水》，并在剧中饰演了女主角夏雨荷；同年，于娜还与众多艺人共同出演了汶川大地震纪实剧《震撼世界的七日》，于娜在剧中饰演了第一批进入重灾区采访的女记者徐宁；此外，于娜还友情出演了现代战争剧《沧海》；以及在与于荣光、郭金、矢野浩二合作主演的动作传奇剧《翡翠凤凰》中饰演了性格坚强且为爱牺牲的刘笑笑；在与陈司翰、费振翔、谢宁等艺人共同出演的浙版《西游记》中饰演了单纯善良的锦毛玉鼠精；在与苏有朋、颜丹晨、范明合作主演的爱情喜剧片《四个丘比特》中饰演了聪明美丽却有一点任性的富家千金女唐娜。 2009年，于娜与居文沛、何中华、袁文康联袂主演了红色谍战片《谍战玫瑰》，并在剧中饰演了睿智勇敢的女主角李娜；随后，于娜又与戚薇、袁成杰、罗家英合作主演了爱情喜剧片《重庆美女》，于娜在剧中饰演了功夫了得且有着侠义心肠的女主角孙小舞；同年，于娜还与张涵予、肖剑、马国兴共同主演了乡村创业喜剧《云下的日子》；此外，于娜还在与佟大为、马伊琍、黄磊合作出演的都市家庭情感剧《婚姻保卫战》中饰演了时尚靓丽且性格独立的陈梦。 2010年，于娜与何中华搭档主演了惊悚谍战片《步步惊心》，并在片中饰演了性格复杂的女主角刘红妹；之后，于娜又与郭品超、李曼、陈浩民等众多艺人共同主演了古装奇幻贺岁剧《十二生肖传奇》；同年，于娜还在与刘洋、周扬、吴庆哲等演员合作出演的古装神话喜剧《天地姻缘七仙女》中饰演了古灵精怪的小妖精金蝎；此外，于娜还与陈思成、李晨、张译共同出演了都市爱情剧《北京爱情故事》；与于荣光、杜淳、罗嘉良合作出演了古装反腐剧《廉石传奇》；以及客串出演了好莱坞魔幻电片《人鱼帝国》。 2011年，于娜与午马、师小红、韩月乔联袂主演了现代文艺片《九里香》，并在片中饰演了羌族女主角孟娜；之后，于娜又在与任贤齐、张柏芝、郑佩佩等艺人合作出演的古装战争片《杨门女将之军令如山》中饰演了身手了得的杨七娘；同年，于娜还与众多演员共同出演了辛亥革命一百周年献礼影片《第一大总统》；此外，于娜还在与韩雪、胡兵、蒋毅联袂主演都市情感剧《亲爱的，回家》中饰演了追求完美且敢爱敢恨的安丽娜；以及与于荣光、秋瓷炫、潘虹合作出演了古装传奇剧《木府风云》。 2012年，于娜与徐僧、伍宇娟、计春华联袂主演了年代传奇剧《热血码头》，并在剧中饰演了充满豪情的女主角花小娇。2013年，于娜出演了系列文化微电影《云居寺传奇》。 2014年,，于娜开始担任第22届新丝路中国模特大赛《超模学院》节目的导师工作；同年12月，于娜还与众多艺人共同出演了电影版《北京爱情故事》。 2015年，于娜与童瑶、于毅、迟帅等人合作主演了现代都市爱情剧《我的麻辣女友》；同年，于娜还与赵骏、王伯昭联袂主演了人物传记电影《顾景舟》。 2016年，于娜与黎明、韩彩英、耿乐共同出演的现代都市悬疑片《不速之客》在全国上映。