1984年，主演越剧电影《五女拜寿》而获得关注。 1986 年，导演谢铁骊启动电影《红楼梦》，共六部八集的电影拍摄历时 3 年，招入了越剧、京剧、吕剧等不同剧种的演员，何赛飞便是其中之一。片中她饰演妙玉，这是她走上银幕的开始。 1991年，参演张艺谋执导的电影《大红灯笼高高挂》，饰演梅珊一角。 1994 年，主演了李少红执导的电影《红粉》和陈凯歌执导的电影《风月》。在《红粉》中，她饰演青楼女子小萼，演得不温不火、恰当好处，这部影片也进一步提高了她的知名度。 1995年，她获得中国电影表演艺术学会奖。 1996 年，她凭借在《敌后武工队》中的表演获得第 19 届大众电影百花奖最佳女配角奖；同年接拍了电视剧《情系国脉》、《汉口往事》、《昨日留言》。 1999年主演电视剧《情迷海上花》。 2000年，她接拍了 20 集电视剧《爱是阳光》，并在剧中任女主角。 2001年，在郭宝昌导演的电视剧《大宅门》中饰演名妓杨九红，凭借在这部电视剧中的表现，何赛飞获得中央电视台美菱杯“观众最喜爱的十佳女演员奖”。 2002年，参与主演电视剧《孝庄秘史》，饰演皇太极最宠爱的宸妃海兰珠。 2003 年，参演郭宝昌执导的电视剧《大宅门第二部》，再度饰演杨九红。 2004年，主演电视剧《月影风荷》，饰演季文月一角。 2005 年主演电视剧《血色残阳》。 2007年 11 月，与汤唯、梁朝伟合作出演李安导演的电影《色戒》，饰演萧太太一角。 2007年 12 月，何赛飞到宁波出演滑稽戏《太太万岁》；同年主演电视剧《江湖兄弟》，剧中何赛飞与施羽出演一对在江湖中飘泊的恋人。 2008年，主演电视剧《祈望》和《纸醉金迷》。 2009年，主演电视剧《娘家的故事》和《侬本多情》。 2010年，主演电视剧《老马家的幸福往事》。 2011年，参与主演电视剧《新女婿时代》和《后宫》。 2012年，出演电视剧《女人泪》和《唐宫燕》，饰演唐中宗李显的妻子韦皇后。 2013年，与佟丽娅 、杨烁合作出演电视剧《刀客家族的女人》； 2013年 4 月，何赛飞主演的电视剧《那金花和她的女婿》在全国各大卫视黄金档播出。 2015 年，加盟主演抗战题材电影《那些女人》，饰演水芹娘； 10 月，主演的喜剧《二毛驴从军记》在横店杀青。 2016年 6 月 ，主演电视剧《老妈的桃花运》，饰演丁香香。 2016年 12 月，主演情感题材电视剧《最亲最爱的人》，饰演甄婕的生母张锦屏。 2017年春晚，表演戏曲《薪火相传》（天上掉下个林妹妹） 2018年 9 月 28 日，凭借电影《那些女人》获得第 16 届平壤国际电影节最佳女主角奖。